《基于MPT64蛋白的噬菌体展示技术筛选结核分枝杆菌特异性单克隆抗体》作者：郭越生，李恒，孟璐【PDF】

书呆熊

基于 MPT64蛋白的噬菌体展示技术筛选结核分枝杆菌特异性单克隆抗体

郭越生1，李恒2，孟璐3

（1. 苏州大学苏州医学院巴斯德学院，苏州市 215123；

• 苏州大学苏州医学院基础医学院，苏州市 215123；
• 复旦大学感染与健康研究院，上海市 200438）
  

摘要：目的•探讨结核分枝杆菌（MTB）特异性分泌蛋白 MPT64 作为分子标志物，开发高特异性单克隆抗体，解决结核病与非结核分枝杆菌（NTM）感染的临床鉴别诊断难题。方法•将MTB H37Rv 菌株 MPT64基因（Rv1980c）克隆至原核表达载体，诱导大肠杆菌表达可溶性蛋白；通过 Ni-IDA 亲和层析纯化获得高纯度MPT64蛋白。MPT64 蛋白作为抗原接种新西兰大白兔，通过间接 ELISA 动态监测血清抗体效价。分离免疫兔脾脏单细胞，提取总 RNA并反转录合成 cDNA；利用轻链（Vx/VX）和重链（VH）可变区引物扩增免疫球蛋白基因，构建 Fab 片段噬菌体展示文库；采用五轮渐进式生物淘选策略，逐步降低抗原包被浓度（10-0.1 u8g/mL.）并辅以酸性洗脱（pH =2.5），富集高亲和力克隆。将筛选获得的抗体可变区基因构建为重组质粒转染 Expi293F细胞表达全长IgG，经 Protein G 亲和纯化后通过间接ELISA测定半最大效应浓度（ECso）。结果•SDS-PAGE 和 Western blot 分析证实重组 MPT64 蛋白（23.99 kDa）在大肠杆菌中高效表达为可溶性蛋白，最终纯化所得蛋白纯度>95%。ELISA结果显示经过四次免疫接种后，大白兔体内 MPT64 特异性抗体显著表达，血清效价达1:256000（P<0.001）；琼脂糖凝胶电泳及噬菌体文库测序结果表明 MPT64 蛋白特异性 Fab噬菌体文库构建成功，经过淘选所得噬菌体文库总容量达 2.59×100cfu.SDS-PAGE 结果表明经过淘选噬菌体文库所得的重组抗体可变区序列在体外成功表达为完整抗体；ELISA 结果分析表明重组单抗 MPT64-Rab01 的EC50为 0.1538ug/mL，显著优于其他候选抗体。结论•本研究通过基因工程与噬菌体展示技术，成功开发出高灵敏度高特异性的抗 MPT64 单克隆抗体，为结核病与 NTM 的精准鉴别诊断提供了关键技术支撑关键词：Fab 噬菌体文库；MPT64 蛋白；结核分枝杆菌；壹组抗体。

中图分类号：请查阅《中国图书馆分类法》